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伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化

摘要

目标:优化伤寒Vi 多糖柱层析纯化工艺,以替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法。办法:采取DEAE 离子交换层析柱,分别在缓冲液(20 mmol/L Tris-ClpH 值为6. 07. 0 8. 0 的条件下纯化1 批伤寒Vi 多糖粗糖,并与传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法停止比较。按《中国药典》三部(2010 版)请求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大年夜小及内毒素含量,并计算样品的多糖收受接收率。采取优化的DEAE 柱层析纯化工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖,验证该工艺的稳定性。成果DEAE 离子交换柱缓冲液(20 mmol /L Tris-ClpH 值为7. 0 8. 0 时,可有效将伤寒Vi 多糖的杂质与纯化产品分别,多糖收受接收率分别为36. 52% 38. 35%,明显高于传统工艺的多糖收受接收率(15. 52%),且纯化产品的内毒素含量(10 EU /μg)明显低于传统工艺(200 EU/μg)。以优化工艺(pH 7. 0)纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖取得的6 批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大年夜小、内毒素含量及多糖收受接收率差别较小,标准误差均小于5%。结论优化了伤寒Vi 多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性优胜,可替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
 
伤寒是由伤寒沙门杆菌惹起的一种急性肠道感染病,该病经肠道感染网状内皮细胞体系、肠道淋巴体系和胆囊而致急性全身性感染。我国自1998 年洪涝灾害后,伤寒病发率逐步降低。据2008 年中国卫生部统计,伤寒或副伤寒的感染率为118/10 万,病逝世率约为0. 04 / 10 万,该病是中国病发率前十位的感染病之一[1]。WHO 推荐应用伤寒Vi 多糖疫苗预防伤寒的风行2。研究注解,大年夜范围的应用伤寒Vi 多糖疫苗,可明显降低伤寒的风行,减轻社会的经济包袱3-4
伤寒Vi 多糖的有效抗原为细胞壁外的荚膜多糖。传统纯化工艺多采取苯酚抽提、乙醇分级沉淀等办法,该办法所应用的提取试剂对情况污染严重,工艺的繁琐招致多糖收受接收率偏低。本实验对纯化条件平和的DEAE 阴离子交换层析法的pH 值停止了分析比较,建立一种步调简单、纯化后果好、情况污染小的伤寒Vi 多糖柱层析纯化工艺,并对该办法的稳定性停止验证,以替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
1 材料及办法
1. 1 样品4 批伤寒Vi 多糖粗糖(批号为STVi20111206STVi 20111207STVi 20120101 STVi20120102)由本公司发酵研究室供给。
1. 2 重要试剂及仪器Tris-Cl 和氯化钠购自国药集团化学试剂无限公司;AKTA explorer 层析体系、DEAE 层析填料和XK26/20 层析柱均购自GE 公司。
1. 3 DEAE柱层析纯化采取AKTA exploere 层析体系,DEAE 填料柱体积为45 ml,用20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)缓冲液充分均衡DEAE柱。称取伤寒Vi 多糖粗糖(STVi 20111206300 mg,按5 mg/ml 融化于20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)缓冲液中,经0. 45 μm 滤膜过滤后,按每毫升填料5 ~ 10 mg 样品上样于预处理好的DEAE 层析柱,流速为3 ~ 6 ml/min,用缓冲液A20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)]淋洗4 ~5 倍柱体积,用缓冲液B20 mmol/L Tris-Cl +0. 5 mol/L NaClpH 6. 07. 0 8. 0)]停止10 ~15倍柱体积的持续梯度洗脱。纯化过程分别用紫外206260280 nm 波长检测多糖、核酸及蛋白含量。搜集穿透峰,除菌过滤后用打针用水透析48 h,置真空枯燥,用于后续检测。
1. 4 传统工艺纯化参考《中国药典》三部(2010 版)5伤寒Vi 多糖疫苗)的办法纯化伤寒Vi 多糖粗糖(STVi20111206)。
1. 5 纯化样品的检测取过量纯化产品,用打针用水融化,根据《中国药典》三部(2010 版)5对纯化产品的蛋白质含量(应小于10 mg/g)、核酸含量(应小于20 mg/g)、O-乙酰基含量(应不低于2. 0 mmol/g)、分子大年夜小(多糖分子的KD 值在0. 25 之前的洗脱液多糖收受接收率应在50%以上)及内毒素含量停止检测,并停止览辨别实验(Vi 多糖与伤寒Vi 血清产生明显沉淀线)。按下式计算多糖收受接收率。
多糖收受接收率(%= 精糖的收量(g/粗糖的投量(g)× 100%
1. 6 DEAE柱层析稳定性的检测采取优化的DEAE柱层析工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖(STVi 2011-1207STVi 20120101 STVi 20120102),并对纯化产品停止相干项目标检测,计算标准差(SD)和变异系数(CV),验证该工艺的稳定性。
2 成果
2. 1 DEAE 柱层析纯化检测成果可见,上样缓冲液为pH 6. 0 20 mmol/L Tris-Cl 时,目标产品流穿,但核酸和杂蛋白未结合在层析柱上,随穿透峰一同穿出;上样缓冲液为pH 7. 0 20 mmol/LTris-Cl 时,目标产品流穿,核酸和杂蛋白结合于层析柱上,并随缓冲液B 梯度的增长逐步被洗脱上去;上样缓冲液为pH 8. 0 20 mmol/L Tris-Cl 时,纯化后果与pH 7. 0条件下类似,见图1
2. 2 纯化样品的剖断检测成果注解,DEAE 柱层析纯化缓冲液pH 值为6. 0 时没法有效去除伤寒Vi多糖中的杂蛋白及核酸,其纯化产品的蛋白质含量是pH 7. 0 pH 8. 0 条件下的17. 86 15. 37 倍,核酸含量是pH 7. 0 pH 8. 0 条件下的5. 25 6. 06倍,内毒素含量远低于传统工艺,仅为传统工艺的5%。见表1。传统工艺纯化多糖收受接收率为15%,而DEAE 柱层析工艺(pH 7. 0 pH 8. 0)纯化多糖收受接收率分别为36. 52%和38. 35%,见表2。由于伤寒Vi 多糖中含O-乙酰基,在碱性条件下O-乙酰基易零落,是以,本实验选择pH 7. 0 为层析纯化的最好条件。
2. 3 DEAE 柱层析的稳定性检测成果注解,以优化工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖取得的6 批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大年夜小、内毒素含量及多糖收受接收率差别较小,标准误差均小于5%。注解该办法具有优胜的稳定性。见表3 和表4
 
 
3 评论辩论
平日在离子交换层析中,pH、离子强度等条件是纯化后果的关键身分,本实验采取DEAE 柱层析纯化多糖是使纯化产品经层析柱后流穿,杂质结合于层析柱上,是以,离子强度对该纯化办法无重要影响。本实验重点是对层析柱的pH 值停止了优化。
实验成果注解,在缓冲液(20 mmol/L Tris-ClpH 6. 0 条件下未能将目标产品与杂质分别,在pH 7. 08. 0 条件下多糖流穿,大年夜部分核酸及蛋白等杂质结合于层析柱上,并随缓冲液B 梯度的增长而被渐渐洗脱上去,由于伤寒Vi 多糖中含O-乙酰基,在碱性条件下O-乙酰基易零落,是以,选择pH 7. 0 作为伤寒Vi 多糖的最好柱层析纯化条件。
为防止疫苗临盆过程当中苯酚等有毒化学试剂及高浓度乙醇、甲醇等易燃易爆的无机溶剂对疫苗质量的影响6-7,采取现代纯化技巧对传统的临盆工艺停止改进,增添或弃用有毒化学试剂,以进步疫苗产品德量。Pato 8商量了流脑C 群荚膜多糖的柱层析纯化工艺,国际也报导层析法对流脑A 群荚膜多糖去杂蛋白的有效性9
伤寒Vi 多糖疫苗的有效抗原部分为荚膜多糖,平日提取荚膜多糖的办法是以Gotschlich 法为基本10,传统伤寒Vi 多糖的提取工艺多采取苯酚抽提、乙醇分级沉淀等办法5-6,11,但苯酚为有毒化学试剂,为该疫苗的应用带来必定的安然隐患,是以,本实验经过过程采取DEAE 离子交换层析,肯定了缓冲液20 mmol/LTris-Cl pH 7. 0 DEAE 层析柱工艺的最好条件,中性pH 值确保了多糖构造的稳定性,进步了纯化产品的质量目标,且明显降低了纯化产品的内毒素含量。
本实验采取优化的DEAE 柱层析工艺对3 批粗糖停止了纯化,实验成果显示,所取得的6 批精糖质量均符合规定,蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大年夜小、内毒素含量及多糖收受接收率差别较小,标准误差均小于5%,注解该工艺具有优胜的稳定性,易于工艺缩小年夜,进步了疫苗的安然性及产品的质量标准,可替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
 
 
参考文献
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